熒光定量PCR檢測技術誕生(shēng)至今已10多年的時間，而其應用一(yī)直都沒廣泛展開(kāi)，究其原因，無外(wài)乎受制于相關儀器、試劑和技術的發展。近期，尤其是08年以來，儀器和試劑是遍地開(kāi)花，這也使科研人員(yuán)均躍躍欲試，都想借此技術使自己的研究能突飛猛進，發展勢頭通過查找每年所發表的文章數可一(yī)目了然。據有關統計，在 Medline 數據庫中(zhōng)，用“Taqman” 或 ”real time PCR” 作爲關鍵詞檢索，1996 年是19 篇，1999 年157 篇，到2003 年就高達2984 篇，2009年會是多少呢？我(wǒ)們不得而知(zhī)。但其迅猛的發展勢頭卻是不可更改的，本公司真誠希望能和衆多研究人員(yuán)共同努力，抓住這一(yī)大(dà)好時機，爲科研事業的發展貢獻自身的力量。基于這一(yī)目标，本公司長期以來對熒光定量PCR，無論是技術還是多年來的産品，均進行了深入地研究，并及時推出更加優異的熒光定量 PCR技術服務。

熒光定量PCR原理

熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，後來也叫Real-Time PCR，是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一(yī)種新的核酸定量技術。該技術是在常規PCR基礎上加入熒光标記探針或相應的熒光染料來實現其定量功能的。其原理：随着PCR反應的進行，PCR反應産物(wù)不斷累計，熒光信号強度也等比例增加。每經過一(yī)個循環，收集一(yī)個熒光強度信号，這樣我(wǒ)們就可以通過熒光強度變化監測産物(wù)量的變化，從而得到一(yī)條熒光擴增曲線圖。

一(yī)般而言，熒光擴增曲線可以分(fēn)成三個階段：熒光背景信号階段，熒光信号指數擴增階段和平台期。在熒光背景信号階段，擴增的熒光信号被熒光背景信号所掩蓋，無法判斷産物(wù)量的變化。而在平台期，擴增産物(wù)已不再呈指數級的增加，PCR 的終産物(wù)量與起始模闆量之間沒有線性關系，根據最終的 PCR 産物(wù)量也不能計算出起始 DNA 拷貝數。隻有在熒光信号指數擴增階段， PCR産物(wù)量的對數值與起始模闆量之間存在線性關系，我(wǒ)們可以選擇在這個階段進行定量分(fēn)析。爲了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術中(zhōng)引入了兩個非常重要的概念：熒光阈值和 CT值(如下(xià)圖所示)。

熒光域值(threshold)

是在熒光擴增曲線上人爲設定的一(yī)個值，它可以設定在熒光信号指數擴增階段任意位置上，但一(yī)般熒光域值的缺省設置是PCR反應前3-15個循環熒光信号标準偏差的10倍，即：threshold。

Ct值與起始模闆的關系：

研究表明，每個模闆的Ct值與該模闆的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小(xiǎo)。利用已知(zhī)起始拷貝數的标準品可作出标準曲線，其中(zhōng)橫坐标代表起始拷貝數的對數，縱坐标代表Ct值如下(xià)圖所示。因此，隻要獲得未知(zhī)樣品的Ct值，即可從标準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

熒光定量檢測

熒光定量檢測根據所使用的标記物(wù)不同可分(fēn)爲熒光探針和熒光染料。熒光探針又(yòu)包括Beacon技術(分(fēn)子信标技術，以美國人Tagyi爲代表)、 TaqMan探針(以美國ABI公司爲代表)和FRET技術(以羅氏公司爲代表)等；熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現在最常用的SYBR GreenⅠ；飽和熒光染料有EvaGreen、LC Green等。

嵌合熒光染料法(SYBR GreenⅠ)

SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結合染料，與雙鏈DNA非特異性結合。在遊離(lí)狀态下(xià)，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一(yī)旦與雙鏈DNA結合，其熒光增加1000倍。所以，一(yī)個反應發出的全部熒光信号與出線的雙鏈DNA量呈比列，且會随擴增産物(wù)的增加而增加。

SYBR Green I熒光染料與DNA雙鏈的結合

雙鏈DNA結合染料的優點：實驗設計簡單，僅需要2個引物(wù)，不需要設計探針，無需設計多個探針即可以快速檢驗多個基因，且能夠進行熔點曲線分(fēn)析，檢驗擴增反應的特異性，低的初始成本，通用性好，因此國内外(wài)在科研中(zhōng)使用比較普遍。

熒光探針法(Taqman 技術)：PCR擴增時，加入一(yī)對引物(wù)的同時再加入一(yī)個特異性的熒光探針。該探針爲一(yī)直線型的寡核苷酸，兩端分(fēn)别标記一(yī)個熒光報告基團和一(yī)個熒光淬滅基團，探針完整時，報告基團發射的熒光信号被淬滅基團吸收，PCR 儀檢測不到熒光信号； PCR擴增時(在延伸階段)，Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性将探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分(fēn)離(lí)，從而熒光監測系統可接收到熒光信号，即每擴增一(yī)條 DNA 鏈，就有一(yī)個熒光分(fēn)子形成，實現了熒光信号的累積與 PCR 産物(wù)形成完全同步，這也是定量的基礎所在。其過程如下(xià)圖所示

熒光定量PCR的應用

分(fēn)子生(shēng)物(wù)學研究

1 核酸定量分(fēn)析。對傳染性疾病進行定量定性分(fēn)析，病原微生(shēng)物(wù)或病毒含量的檢測 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 轉基因動植物(wù)基因拷貝數的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。

2 基因表達差異分(fēn)析。比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物(wù)處理、物(wù)理處理、化學處理等) ，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA芯片或差顯結果的确證

3 SNP 檢測。檢測單核苷酸多态性對于研究個體(tǐ)對不同疾病的易感性或者個體(tǐ)對特定藥物(wù)的不同反應有着重要的意義，因分(fēn)子信标結構的巧妙性，一(yī)旦SNP 的序列信息是已知(zhī)的，采用這種技術進行高通量的 SNP 檢測将會變得簡單而準确。

4 甲基化檢測。甲基化同人類的許多疾病有關，特别是癌症， Laird 報道了一(yī)種稱作 Methylight的技術，在擴增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物(wù)和 Taqman探針來區分(fēn)甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。

醫學研究

5 産前診斷：人們對遺傳性物(wù)質改變引起的遺傳性疾病還無法治療，到目前爲止，還隻能隻能通過産前監測，減少病嬰出生(shēng)，以防止各類遺傳性疾病的發生(shēng)，如爲減少X連鎖遺傳病患兒的出生(shēng)，從孕婦的外(wài)周血中(zhōng)分(fēn)離(lí)胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性别決定區基因是一(yī)種無創傷性的方法，易爲孕婦所接受。

6 病原體(tǐ)檢測：采用熒光定量PCR檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體(tǐ)、解脲支原體(tǐ)、人類乳頭瘤病毒、單純疱疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結核分(fēn)枝杆菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體(tǐ)進行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優點。

7 藥物(wù)療效考核：對乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分(fēn)析顯示：病毒量與某些藥物(wù)的療效關系。HCV高水平表達，幹擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，幹擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中(zhōng)，HBV- DNA的血清含量曾有下(xià)降，随後若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發生(shēng)變異。

8 腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發病的機理尚未清楚，但相關基因發生(shēng)突變是緻癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。實時熒光定量 PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準确檢測癌基因的表達量。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢(màn)性粒細胞性白(bái)血病WT1基因、腫瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。